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用比濁法測定大腸桿菌的生長曲線

原理
將一定數(shù)量的細菌,接種于適宜的液體培養(yǎng)基中,在適溫下培養(yǎng),定時取樣測數(shù),以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標,生長時間為橫坐標,作出的曲線稱為生長曲線。該曲線表明細菌在一定的環(huán)境條件下群體生長與繁殖的規(guī)律。一般分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期四個時期,各時期的長短同菌種本身特征、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不同而異。
比濁法是根據(jù)細菌懸液細胞數(shù)與混濁度成正比,與透光度成反比關系,利用光電比色計測定細胞懸液的光密度(即OD值),用于表示該菌在本實驗條件下的相對生長量。
實驗設正常生長、加酸抑制和加富培養(yǎng)等三種處理,以了解細菌在不同生長條件下的生長情況。 
材料與儀器
大腸桿菌 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 無菌酸溶液 無菌吸管 搖床 冰箱 光電比色計 標簽
步驟
一、實驗器材
1. 活材料:大腸桿菌(E.coli)。
2. 培養(yǎng)基和試劑:牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基14支(每支10 mL),濃縮5 倍的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1支。無菌酸溶液(甲酸:乙酸:乳酸=3:1:1)。
3. 器材:1 mL無菌吸管、搖床、冰箱、光電比色計、標簽等。
二、實驗步驟
1. 接種
取13支裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的試管,貼上標簽(注明菌名、培養(yǎng)處理、培養(yǎng)時間、組號)。按無菌操作法用吸管向每管準確加入0.2 mL的大腸桿菌培養(yǎng)液,接種后,輕輕搖蕩,使菌體混勻。另一支不接種的培養(yǎng)管注明CK(對照)。
2. 培養(yǎng)
將接種后的培養(yǎng)管置于搖床上,在37℃下振蕩培養(yǎng)。其中9支培養(yǎng)管分別于培養(yǎng)的0、1.5、3、4、6、8、10、12和14 h后取山,放冰箱中貯存,待測定。加酸處理。取出經(jīng)4h培養(yǎng)的另二支培養(yǎng)管,按無菌操作法加入1 mL無菌酸溶液,搖勻后放回搖床上,繼續(xù)振蕩培養(yǎng),于培養(yǎng)8 h和14 h后取出放冰箱中貯存,待測定。加富營養(yǎng)物處理。余下的二支培養(yǎng)管于培養(yǎng)6h后取出,按無菌操作法加入濃縮5倍的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液1 mL,搖勻后,繼續(xù)進行振蕩培養(yǎng),于培養(yǎng)8 h和14 h后取出,放入冰箱中貯存,待測定。
3. 比濁
將培養(yǎng)不同時間、形成不同細胞濃度的細菌培養(yǎng)液進行適當稀釋,使光密度值在0.0-0.4范圍內(nèi),以未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零點,在光電比色計上,選用400-440nm波長的濾光片進行比濁,從最稀濃度的菌懸液開始,依次測定。
4. 可選步驟
將大腸桿菌接入裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的小試管中(試管要能插入放比色杯的比色槽內(nèi))。37℃下振蕩培養(yǎng),分別在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14 h取出,以未接種培養(yǎng)液調(diào)零點,在光電比色計上比色。比色時應自制一個暗盒將培養(yǎng)管和比色槽罩住,以形成一個暗室。
三、繪制曲線
以細菌懸液的光密度值(OD)為縱坐標,培養(yǎng)時間為橫坐標,給出大腸桿菌在正常生長、加酸處理和加富培養(yǎng)三種條件下的生長曲線。
如果我們將上述培養(yǎng)0,1.5,3,4,6,8,10,12,14h的細菌懸液用稀釋平板測數(shù)法進行測數(shù),測出不同時間的含菌數(shù),以菌懸液比濁的光密度值為橫坐標,以細菌的數(shù)量為縱坐標,繪制一標準曲線,這樣在測得了任一培養(yǎng)時間的菌懸液光密度值后,就可以在此標淮曲線上查出含菌數(shù)。這種方法已在工業(yè)上廣泛采用,它可以節(jié)省許多稀釋平板測數(shù)的時間, 直接用比濁法測得的光密度值查標準曲線以了解各個培養(yǎng)時期的菌數(shù)消長情況。 
注意事項
1.細胞生長需要在適宜的溫度和PH值下,每個細菌的生長條件不同,需要對不同種類的細菌進行不同條件的處理。
2. 大腸桿菌是無需氧型細菌,需要對大腸桿菌的環(huán)境進行控氧。
常見問題
如果我們將上述培養(yǎng)0,1.5,3,4,6,8,10,12,14h的細菌懸液用稀釋平板測數(shù)法進行測數(shù),測出不同時間的含菌數(shù),以菌懸液比濁的光密度值為橫坐標,以細菌的數(shù)量為縱坐標,繪制一標準曲線,這樣在測得了任一培養(yǎng)時間的菌懸液光密度值后,就可以在此標淮曲線上查出含菌數(shù)。這種方法已在工業(yè)上廣泛采用,它可以節(jié)省許多稀釋平板測數(shù)的時間, 直接用比濁法測得的光密度值查標準曲線以了解各個培養(yǎng)時期的菌數(shù)消長情況。
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